BDDE کراس سے منسلک آٹوکلیو میں نئے رد عمل کے ضمنی مصنوعات کا پتہ لگانا

جاوا اسکرپٹ فی الحال آپ کے براؤزر میں غیر فعال ہے۔جاوا اسکرپٹ کو غیر فعال کرنے پر، اس ویب سائٹ کے کچھ فنکشن کام نہیں کریں گے۔
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgenia Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Spain * ان مصنفین کے پاس اس کام کے بارے میں کچھ بصیرتیں ہیں۔ شراکت کا پس منظر: Hyaluronic ایسڈ (HA) قدرتی طور پر پایا جانے والا پولی سیکرائیڈ ہے جو جمالیاتی مقاصد کے لیے ڈرمل فلرز کی تیاری میں استعمال ہوتا ہے۔چونکہ انسانی بافتوں میں اس کی نصف زندگی کئی دنوں تک ہوتی ہے، اس لیے HA پر مبنی ڈرمل فلرز کو کیمیاوی طور پر تبدیل کیا جاتا ہے تاکہ جسم میں ان کی زندگی کو بڑھایا جا سکے۔کمرشل HA پر مبنی فلرز میں سب سے عام ترمیم 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) کو HA چینز کو کراس لنک کرنے کے لیے کراس لنکنگ ایجنٹ کے طور پر استعمال کرنا ہے۔بقایا یا غیر رد عمل والے BDDE کو <2 حصوں فی ملین (ppm) پر غیر زہریلا سمجھا جاتا ہے؛لہذا، مریض کی حفاظت کو یقینی بنانے کے لیے حتمی ڈرمل فلر میں بقایا BDDE کی مقدار درست کی جانی چاہیے۔مواد اور طریقے: یہ مطالعہ مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS) کو ملا کر الکلائن حالات میں BDDE اور HA کے درمیان کراس لنکنگ ری ایکشن کے ضمنی پروڈکٹ کی کھوج اور خصوصیت کو بیان کرتا ہے۔نتائج: مختلف تجزیوں کے بعد، یہ پایا گیا کہ HA-BDDE ہائیڈروجل کو جراثیم کشی کے لیے استعمال کیے جانے والے الکلائن حالات اور اعلی درجہ حرارت نے اس نئے ضمنی پروڈکٹ، "پروپیلین گلائکول نما" مرکب کی تشکیل کو فروغ دیا۔LC-MS تجزیہ نے اس بات کی تصدیق کی کہ ضمنی پروڈکٹ میں BDDE جیسا مونوسوٹوک ماس ہے، ایک مختلف برقرار رکھنے کا وقت (tR)، اور ایک مختلف UV جاذب (λ=200 nm) موڈ ہے۔BDDE کے برعکس، LC-MS تجزیہ میں یہ دیکھا گیا کہ پیمائش کے انہی حالات میں، اس ضمنی پروڈکٹ میں 200 nm پر پتہ لگانے کی شرح زیادہ ہے۔نتیجہ: یہ نتائج بتاتے ہیں کہ اس نئے کمپاؤنڈ کی ساخت میں کوئی epoxide نہیں ہے۔تجارتی مقاصد کے لیے HA-BDDE ہائیڈروجیل (HA ڈرمل فلر) کی تیاری میں پائے جانے والے اس نئے ضمنی پروڈکٹ کے خطرے کا جائزہ لینے کے لیے بحث کھلی ہے۔مطلوبہ الفاظ: ہائیلورونک ایسڈ، ایچ اے ڈرمل فلر، کراس لنکڈ ہائیلورونک ایسڈ، بی ڈی ڈی ای، ایل سی-ایم ایس تجزیہ، بی ڈی ڈی ای بائی پروڈکٹ۔
ہائیلورونک ایسڈ (HA) پر مبنی فلرز کاسمیٹک مقاصد کے لیے استعمال ہونے والے سب سے عام اور مقبول ڈرمل فلرز ہیں۔1 یہ ڈرمل فلر ایک ہائیڈروجیل ہے، جو عام طور پر> 95% پانی اور 0.5-3% HA پر مشتمل ہوتا ہے، جو انہیں جیل جیسا ڈھانچہ دیتا ہے۔2 HA ایک پولی سیکرائڈ ہے اور کشیرکا جانوروں کے ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کا بنیادی جزو ہے۔اجزاء میں سے ایک۔یہ (1,4)-گلوکورونک ایسڈ-β (1,3)-N-acetylglucosamine (GlcNAc) پر مشتمل ہوتا ہے جو گلائکوسیڈک بانڈز سے جڑے ہوئے ڈسکارائیڈ یونٹس کو دہراتی ہے۔یہ ڈسکارائیڈ پیٹرن تمام جانداروں میں یکساں ہے۔کچھ پروٹین پر مبنی فلرز (جیسے کولیجن) کے مقابلے میں، یہ خاصیت HA کو ایک انتہائی بایو مطابقت پذیر مالیکیول بناتی ہے۔یہ فلرز امینو ایسڈ کی ترتیب کی مخصوصیت کو ظاہر کر سکتے ہیں جسے مریض کے مدافعتی نظام سے پہچانا جا سکتا ہے۔
جب ڈرمل فلر کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے تو، HA کی بنیادی حد ٹشوز کے اندر اس کا تیز رفتار ٹرن اوور ہے جس کی وجہ انزائمز کے ایک مخصوص خاندان کی موجودگی ہے جسے hyaluronidases کہتے ہیں۔اب تک، HA کے ڈھانچے میں کئی کیمیائی تبدیلیاں بیان کی گئی ہیں تاکہ ٹشوز میں HA کی نصف زندگی کو بڑھایا جا سکے۔3 ان میں سے اکثر ترامیم HA زنجیروں کو کراس لنک کرکے پولی سیکرائیڈ پولیمر تک ہائیلورونیڈیز کی رسائی کو کم کرنے کی کوشش کرتی ہیں۔لہذا، HA ڈھانچے اور کراس لنکنگ ایجنٹ کے درمیان پلوں کی تشکیل اور بین مالیکیولر کوولنٹ بانڈز کی وجہ سے، کراس سے منسلک HA ہائیڈروجل قدرتی HA کے مقابلے زیادہ اینٹی انزائم انحطاط کی مصنوعات تیار کرتا ہے۔4-6
اب تک، کراس لنکڈ HA تیار کرنے کے لیے استعمال ہونے والے کیمیکل کراس لنکنگ ایجنٹوں میں میتھکریلامائیڈ، 7 ہائیڈرزائڈ، 8 کاربوڈیمائیڈ، 9 ڈیوینائل سلفون، 1,4-بوٹانیڈیول ڈیگلیسیڈیل ایتھر (BDDE) اور پولی (ایتھیلین گلائکول) ڈائگلیسیڈیل ایتھر شامل ہیں۔10,11 BDDE اس وقت سب سے زیادہ استعمال ہونے والا کراس لنکنگ ایجنٹ ہے۔اگرچہ اس قسم کے ہائیڈروجلز کو کئی دہائیوں سے محفوظ ثابت کیا گیا ہے، لیکن جو کراس لنکنگ ایجنٹ استعمال کیے گئے ہیں وہ ری ایکٹیو ریجنٹس ہیں جو سائٹوٹوکسک اور بعض صورتوں میں میوٹیجینک ہو سکتے ہیں۔12 لہذا، حتمی ہائیڈروجیل میں ان کا بقایا مواد زیادہ ہونا چاہیے۔BDDE محفوظ سمجھا جاتا ہے جب بقایا ارتکاز 2 حصے فی ملین (ppm) سے کم ہو۔4
HA ہائیڈروجلز میں کم باقیات والے BDDE ارتکاز، کراس لنکنگ ڈگری اور متبادل پوزیشن کا پتہ لگانے کے کئی طریقے ہیں، جیسے گیس کرومیٹوگرافی، ماس اسپیکٹومیٹری (MS) کے ساتھ جوہری مقناطیسی گونج (NMR) فلوروسینس پیمائش کے طریقے، اور ڈایڈڈ سرنی مل کر اعلی کارکردگی مائع کرومیٹوگرافی (HPLC)۔13-17 یہ مطالعہ الکلین حالات میں BDDE اور HA کے رد عمل سے تیار کردہ حتمی کراس سے منسلک HA ہائیڈروجل میں ایک ضمنی پروڈکٹ کا پتہ لگانے اور خصوصیت کی وضاحت کرتا ہے۔HPLC اور مائع کرومیٹوگرافی-ماس اسپیکٹومیٹری (LC-MS تجزیہ)۔چونکہ BDDE کے اس ضمنی پروڈکٹ کی زہریلا پن معلوم نہیں ہے، اس لیے ہم تجویز کرتے ہیں کہ اس کی باقیات کی مقدار کا تعین اسی طریقے سے کیا جانا چاہیے جو عام طور پر BDDE پر حتمی پروڈکٹ میں کیا جاتا ہے۔
HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) کے حاصل کردہ سوڈیم نمک کا مالیکیولر وزن ~1,368,000 Da (Laurent طریقہ) 18 اور اندرونی چپکنے والی 2.20 m3/kg ہے۔کراس لنکنگ ری ایکشن کے لیے، BDDE (≥95%) سگما-الڈرچ کمپنی (سینٹ لوئس، MO، USA) سے خریدا گیا تھا۔پی ایچ 7.4 کے ساتھ فاسفیٹ بفرڈ نمکین سگما-الڈرچ کمپنی سے خریدا گیا تھا۔LC-MS تجزیہ میں استعمال ہونے والے تمام سالوینٹس، acetonitrile اور پانی HPLC گریڈ کے معیار سے خریدے گئے تھے۔فارمک ایسڈ (98%) ری ایجنٹ گریڈ کے طور پر خریدا جاتا ہے۔
تمام تجربات UPLC ایکویٹی سسٹم (Waters, Milford, MA, USA) پر کیے گئے تھے اور ایک API 3000 ٹرپل کواڈروپول ماس اسپیکٹومیٹر سے منسلک تھے جو الیکٹرو سپرے آئنائزیشن سورس (AB SCIEX, Framingham, MA, USA) سے لیس تھا۔
کراس لنکڈ HA ہائیڈروجلز کی ترکیب 1% الکالی (سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ، NaOH) کی موجودگی میں 10% (w/w) سوڈیم ہائیلورونیٹ (NaHA) محلول میں 198 mg BDDE شامل کرکے شروع کی گئی۔رد عمل کے مرکب میں حتمی BDDE ارتکاز 9.9 mg/mL (0.049 mM) تھا۔اس کے بعد، رد عمل کے مرکب کو اچھی طرح سے ملایا گیا اور ہم آہنگ کیا گیا اور اسے 4 گھنٹے تک 45 ° C پر آگے بڑھنے دیا گیا۔19 رد عمل کا pH ~12 پر برقرار ہے۔
اس کے بعد، رد عمل کے مرکب کو پانی سے دھویا گیا، اور حتمی HA-BDDE ہائیڈروجیل کو فلٹر کیا گیا اور PBS بفر سے پتلا کیا گیا تاکہ 10 سے 25 mg/mL کی HA ارتکاز، اور حتمی pH 7.4 حاصل کیا جا سکے۔تیار کردہ کراس لنکڈ HA ہائیڈروجلز کو جراثیم سے پاک کرنے کے لیے، یہ تمام ہائیڈروجلز آٹوکلیو کیے جاتے ہیں (20 منٹ کے لیے 120°C)۔پیوریفائیڈ BDDE-HA ہائیڈروجیل کو تجزیہ تک 4°C پر ذخیرہ کیا جاتا ہے۔
کراس سے منسلک HA پروڈکٹ میں موجود BDDE کا تجزیہ کرنے کے لیے، 240 ملی گرام کے نمونے کا وزن کیا گیا اور اسے سینٹر ہول (Microcon®؛ مرک ملی پور، بلریکا، MA، USA؛ حجم 0.5 mL) میں داخل کیا گیا اور کمرے کے درجہ حرارت پر 10,000 rpm پر سینٹرفیوج کیا گیا۔ 10 منٹکل 20 µL پل-ڈاؤن مائع اکٹھا کیا گیا اور تجزیہ کیا گیا۔
الکلین حالات (1%، 0.1% اور 0.01% NaOH) کے تحت BDDE معیار (Sigma-Aldrich Co) کا تجزیہ کرنے کے لیے، اگر درج ذیل شرائط پوری ہوتی ہیں، تو مائع کا نمونہ 1:10، 1:100، یا اس سے زیادہ ہے۔ 1:1,000,000 اگر ضروری ہو تو، تجزیہ کے لیے MilliQ deionized پانی استعمال کریں۔
کراس لنکنگ ری ایکشن میں استعمال ہونے والے ابتدائی مواد کے لیے (HA 2%, H2O, 1% NaOH، اور 0.049 mM BDDE)، ان مواد سے تیار کردہ ہر نمونے کے 1 ملی لیٹر کا تجزیہ انہی حالات کے استعمال سے کیا گیا۔
آئن میپ میں ظاہر ہونے والی چوٹیوں کی مخصوصیت کا تعین کرنے کے لیے، 10 µL 100 ppb BDDE معیاری حل (Sigma-Aldrich Co) کو 20 µL نمونے میں شامل کیا گیا۔اس صورت میں، ہر نمونے میں معیار کا حتمی ارتکاز 37 پی پی بی ہے۔
سب سے پہلے، معیاری BDDE (Sigma-Aldrich Co) کے 10 μL کو 990 μL MilliQ پانی (کثافت 1.1 g/mL) کے ساتھ ملا کر 11,000 mg/L (11,000 ppm) کے ارتکاز کے ساتھ BDDE اسٹاک سلوشن تیار کریں۔اس محلول کو 110 µg/L (110 ppb) BDDE محلول کو انٹرمیڈیٹ اسٹینڈرڈ ڈائلیشن کے طور پر تیار کرنے کے لیے استعمال کریں۔اس کے بعد، 75، 50، 25، 10، اور 1 پی پی بی کی مطلوبہ ارتکاز کو حاصل کرنے کے لیے انٹرمیڈیٹ ڈائیلوئنٹ کو کئی بار پتلا کرکے معیاری وکر تیار کرنے کے لیے انٹرمیڈیٹ BDDE اسٹینڈرڈ ڈیلوئنٹ (110 ppb) کا استعمال کریں۔جیسا کہ شکل 1 میں دکھایا گیا ہے، یہ پایا گیا ہے کہ 1.1 سے 110 ppb تک کے BDDE معیاری وکر میں اچھی لکیریٹی (R2>0.99) ہے۔معیاری وکر کو چار آزاد تجربوں میں دہرایا گیا۔
شکل 1 BDDE معیاری کیلیبریشن وکر جو LC-MS تجزیہ کے ذریعے حاصل کیا گیا ہے، جس میں ایک اچھا ارتباط دیکھا گیا ہے (R2>0.99)۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری۔
کراس سے منسلک HA میں موجود BDDE معیارات اور بنیادی حل میں BDDE معیارات کی شناخت اور مقدار درست کرنے کے لیے، LC-MS تجزیہ استعمال کیا گیا۔
کرومیٹوگرافک علیحدگی LUNA 2.5 µm C18(2)-HST کالم (50×2.0 mm2؛ Phenomenex, Torrance, CA, USA) پر حاصل کی گئی تھی اور تجزیہ کے دوران کمرے کے درجہ حرارت (25 ° C) پر رکھی گئی تھی۔موبائل فیز ایسٹونیٹرائل (سالوینٹ اے) اور پانی (سالوینٹ بی) پر مشتمل ہوتا ہے جس میں 0.1% فارمک ایسڈ ہوتا ہے۔موبائل کا مرحلہ تدریجی اخراج کے ذریعے ختم ہوتا ہے۔میلان درج ذیل ہے: 0 منٹ، 2% A؛1 منٹ، 2% A؛6 منٹ، 98% A؛7 منٹ، 98% A؛7.1 منٹ، 2% A؛10 منٹ، 2% A۔ چلانے کا وقت 10 منٹ ہے اور انجیکشن کا حجم 20 μL ہے۔BDDE کا برقرار رکھنے کا وقت تقریباً 3.48 منٹ ہے (تجربات کی بنیاد پر 3.43 سے 4.14 منٹ تک)۔موبائل فیز کو LC-MS تجزیہ کے لیے 0.25 mL/min کی بہاؤ کی شرح سے پمپ کیا گیا تھا۔
MS کے ذریعے BDDE کے تجزیہ اور مقدار کے تعین کے لیے، UPLC سسٹم (واٹرس) کو API 3000 ٹرپل کواڈروپول ماس اسپیکٹرومیٹر (AB SCIEX) کے ساتھ جوڑا جاتا ہے جو الیکٹرو سپرے آئنائزیشن سورس سے لیس ہوتا ہے، اور تجزیہ مثبت آئن موڈ (ESI+) میں کیا جاتا ہے۔
بی ڈی ڈی ای پر کیے گئے آئن فریگمنٹ تجزیہ کے مطابق، سب سے زیادہ شدت والا ٹکڑا 129.1 ڈا (شکل 6) کے مساوی ٹکڑا ہونے کا تعین کیا گیا تھا۔لہذا، مقدار کے تعین کے لیے ملٹی آئن مانیٹرنگ موڈ (MIM) میں، BDDE کا ماس کنورژن (ماس ٹو چارج ریشو [m/z]) 203.3/129.1 Da ہے۔یہ LC-MS تجزیہ کے لیے فل اسکین (FS) موڈ اور پروڈکٹ آئن اسکین (PIS) موڈ کا بھی استعمال کرتا ہے۔
طریقہ کار کی خصوصیت کی تصدیق کرنے کے لیے، ایک خالی نمونہ (ابتدائی موبائل مرحلہ) کا تجزیہ کیا گیا۔خالی نمونے میں 203.3/129.1 Da کے بڑے پیمانے پر تبدیلی کے ساتھ کوئی سگنل نہیں ملا۔تجربے کی تکرار کے بارے میں، 55 پی پی بی کے 10 معیاری انجیکشن (انشانکن وکر کے وسط میں) کا تجزیہ کیا گیا، جس کے نتیجے میں بقایا معیاری انحراف (RSD) <5% (ڈیٹا نہیں دکھایا گیا)۔
بقایا BDDE مواد کو آٹھ مختلف آٹوکلیوڈ BDDE کراس لنکڈ HA ہائیڈروجلز میں مقدار میں طے کیا گیا تھا، جو چار آزاد تجربوں کے مطابق تھا۔جیسا کہ "مواد اور طریقے" سیکشن میں بیان کیا گیا ہے، مقدار کا اندازہ بی ڈی ڈی ای اسٹینڈرڈ ڈیلیوشن کے ریگریشن کریو کی اوسط قدر سے کیا جاتا ہے، جو کہ 203.3/129.1 Da کی BDDE ماس ٹرانزیشن میں پائی جانے والی منفرد چوٹی کے مساوی ہے، جس میں برقرار رکھا گیا ہے۔ 3.43 سے 4.14 منٹ کا وقت انتظار نہیں کرنا۔شکل 2 10 ppb BDDE حوالہ معیار کا ایک مثال کرومیٹوگرام دکھاتا ہے۔جدول 1 آٹھ مختلف ہائیڈروجلز کے بقایا BDDE مواد کا خلاصہ کرتا ہے۔قدر کی حد 1 سے 2.46 پی پی بی ہے۔لہذا، نمونے میں بقایا BDDE ارتکاز انسانی استعمال کے لیے قابل قبول ہے (<2 ppm)۔
10 ppb BDDE حوالہ معیار (Sigma-Aldrich Co) کا تصویر 2 آئن کرومیٹوگرام، 203.30/129.10 Da (مثبت MRM موڈ میں) کے LC-MS تجزیہ کے ذریعے حاصل کردہ MS (m/z) ٹرانزیشن۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی؛ایم ایس، ماس؛m/z، ماس ٹو چارج ریشو۔
نوٹ: نمونے 1-8 آٹوکلیوڈ BDDE کراس لنکڈ HA ہائیڈروجلز ہیں۔ہائیڈروجیل میں BDDE کی بقایا مقدار اور BDDE برقرار رکھنے کے وقت کی چوٹی بھی بتائی جاتی ہے۔آخر میں، مختلف برقرار رکھنے کے اوقات کے ساتھ نئی چوٹیوں کے وجود کی بھی اطلاع ہے۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA، hyaluronic ایسڈ؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی؛ٹی آر، برقرار رکھنے کا وقت؛LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛RRT، متعلقہ برقرار رکھنے کا وقت۔
حیرت انگیز طور پر، LC-MS آئن کرومیٹوگرام کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ تجزیہ کیے گئے تمام آٹوکلیوڈ کراس سے منسلک HA ہائیڈروجل کے نمونوں کی بنیاد پر، 2.73 سے 3.29 منٹ کے مختصر برقرار رکھنے کے وقت میں ایک اضافی چوٹی تھی۔مثال کے طور پر، شکل 3 کراس سے منسلک HA نمونے کا آئن کرومیٹوگرام دکھاتا ہے، جہاں ایک اضافی چوٹی تقریباً 2.71 منٹ کے مختلف برقرار رکھنے کے وقت ظاہر ہوتی ہے۔BDDE سے نئی مشاہدہ شدہ چوٹی اور چوٹی کے درمیان مشاہدہ شدہ رشتہ دار برقرار رکھنے کا وقت (RRT) 0.79 (ٹیبل 1) پایا گیا۔چونکہ ہم جانتے ہیں کہ LC-MS تجزیہ میں استعمال ہونے والے C18 کالم میں نئی ​​مشاہدہ کی گئی چوٹی کو کم رکھا گیا ہے، اس لیے نئی چوٹی BDDE سے زیادہ قطبی مرکب سے مطابقت رکھتی ہے۔
شکل 3 LC-MS (MRM ماس کنورژن 203.3/129.0 Da) کے ذریعے حاصل کردہ کراس سے منسلک HA ہائیڈروجیل نمونے کا آئن کرومیٹوگرام۔
مخففات: HA, hyaluronic acid;LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی؛RRT، رشتہ دار برقرار رکھنے کا وقت؛ٹی آر، برقرار رکھنے کا وقت۔
اس امکان کو مسترد کرنے کے لیے کہ جو نئی چوٹیوں کا مشاہدہ کیا گیا ہے وہ ممکنہ طور پر استعمال کیے جانے والے خام مال میں موجود آلودگی ہیں، ان خام مال کا تجزیہ بھی اسی LC-MS تجزیہ کے طریقہ کار سے کیا گیا تھا۔تجزیہ کیے گئے ابتدائی مواد میں پانی، پانی میں 2% NaHA، پانی میں 1% NaOH، اور BDDE اسی ارتکاز میں شامل ہیں جو کراس لنکنگ ری ایکشن میں استعمال ہوتے ہیں۔استعمال ہونے والے ابتدائی مواد کے آئن کرومیٹوگرام نے کوئی مرکب یا چوٹی نہیں دکھائی، اور اس کا برقرار رکھنے کا وقت مشاہدہ کی گئی نئی چوٹی کے مساوی ہے۔یہ حقیقت اس خیال کو رد کر دیتی ہے کہ نہ صرف ابتدائی مواد میں کوئی مرکبات یا مادہ شامل ہو سکتا ہے جو تجزیہ کے طریقہ کار میں مداخلت کر سکتا ہے، بلکہ لیبارٹری کی دیگر مصنوعات کے ساتھ ممکنہ آلودگی کا کوئی نشان نہیں ہے۔BDDE اور نئی چوٹیوں کے LC-MS تجزیہ کے بعد حاصل کردہ ارتکاز کی قدریں جدول 2 (نمونے 1-4) اور شکل 4 میں آئن کرومیٹوگرام میں دکھائی گئی ہیں۔
نوٹ: نمونے 1-4 آٹوکلیوڈ BDDE کراس لنکڈ HA ہائیڈروجلز بنانے کے لیے استعمال ہونے والے خام مال سے مطابقت رکھتے ہیں۔یہ نمونے آٹوکلیو نہیں تھے۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA، hyaluronic ایسڈ؛LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی.
شکل 4 HA اور BDDE کے کراس لنکنگ ری ایکشن میں استعمال ہونے والے خام مال کے نمونے کے LC-MS کرومیٹوگرام سے مماثل ہے۔
نوٹ: یہ سب ایک ہی ارتکاز اور تناسب سے ماپا جاتا ہے جو کراس لنکنگ رد عمل کو انجام دینے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔کرومیٹوگرام کے ذریعے تجزیہ کیے گئے خام مال کے نمبر اس کے مساوی ہیں: (1) پانی، (2) 2% HA آبی محلول، (3) 1% NaOH آبی محلول۔LC-MS تجزیہ 203.30/129.10 Da (مثبت MRM موڈ میں) کے بڑے پیمانے پر تبدیلی کے لیے کیا جاتا ہے۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;HA، hyaluronic ایسڈ؛LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی.
ان حالات کا مطالعہ کیا گیا جو نئی چوٹیوں کی تشکیل کا باعث بنے۔اس بات کا مطالعہ کرنے کے لیے کہ کراس سے منسلک HA ہائیڈروجل پیدا کرنے کے لیے استعمال ہونے والے رد عمل کی شرائط BDDE کراس لنکنگ ایجنٹ کی رد عمل کو کیسے متاثر کرتی ہیں، جس سے نئی چوٹیوں (ممکنہ ضمنی مصنوعات) کی تشکیل ہوتی ہے، مختلف پیمائشیں کی گئیں۔ان تعیین میں، ہم نے حتمی BDDE کراس لنکر کا مطالعہ اور تجزیہ کیا، جس کا علاج NaOH کے مختلف ارتکاز (0%, 1%, 0.1%, اور 0.01%) کے ساتھ ایک آبی میڈیم میں کیا گیا تھا، اس کے بعد آٹوکلیونگ یا اس کے بغیر۔بیکٹیریا کا طریقہ کار انہی حالات کی تقلید کے لیے وہی طریقہ ہے جو کراس سے منسلک HA ہائیڈروجیل کو تیار کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔جیسا کہ "مواد اور طریقے" سیکشن میں بیان کیا گیا ہے، نمونے کی بڑے پیمانے پر منتقلی کا تجزیہ LC-MS نے 203.30/129.10 Da میں کیا۔بی ڈی ڈی ای اور نئی چوٹی کے ارتکاز کا حساب لگایا گیا ہے، اور نتائج ٹیبل 3 میں دکھائے گئے ہیں۔ ان نمونوں میں کوئی نئی چوٹی نہیں پائی گئی جو آٹوکلیوڈ نہ ہوں، حل میں NaOH کی موجودگی سے قطع نظر (نمونے 1-4، ٹیبل 3)۔آٹوکلیوڈ نمونوں کے لیے، نئی چوٹیوں کا پتہ صرف محلول میں NaOH کی موجودگی میں ہوتا ہے، اور ایسا لگتا ہے کہ چوٹی کی تشکیل محلول میں NaOH کے ارتکاز پر منحصر ہے (نمونے 5-8، جدول 3) (RRT = 0.79)۔شکل 5 آئن کرومیٹوگرام کی ایک مثال دکھاتی ہے، جس میں NAOH کی موجودگی یا غیر موجودگی میں دو آٹوکلیوڈ نمونے دکھائے گئے ہیں۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی.
نوٹ: ٹاپ کرومیٹوگرام: نمونے کا علاج 0.1% NaOH آبی محلول کے ساتھ کیا گیا اور آٹوکلیوڈ (20 منٹ کے لیے 120 ° C)۔باٹم کرومیٹوگرام: نمونے کا علاج NaOH سے نہیں کیا گیا تھا، لیکن انہی حالات میں آٹوکلیو کیا گیا تھا۔203.30/129.10 Da (مثبت MRM موڈ میں) کی بڑے پیمانے پر تبدیلی کا تجزیہ LC-MS نے کیا۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی.
تمام آٹوکلیوڈ نمونوں میں، NaOH کے ساتھ یا اس کے بغیر، BDDE کا ارتکاز بہت کم ہوا (16.6 گنا تک) (نمونے 5-8، جدول 2)۔بی ڈی ڈی ای کے ارتکاز میں کمی اس حقیقت کی وجہ سے ہو سکتی ہے کہ زیادہ درجہ حرارت پر، پانی 1,2-ڈائیول کمپاؤنڈ بنانے کے لیے بی ڈی ڈی ای کے ایپوکسائڈ رِنگ کو کھولنے کے لیے ایک بیس (نیوکلیوفائل) کے طور پر کام کر سکتا ہے۔اس کمپاؤنڈ کا monoisotopic معیار BDDE سے مختلف ہے اور اس لیے اس پر کوئی اثر نہیں پڑے گا۔LC-MS نے 203.30/129.10 Da کی بڑے پیمانے پر تبدیلی کا پتہ لگایا۔
آخر میں، یہ تجربات ظاہر کرتے ہیں کہ نئی چوٹیوں کی نسل کا انحصار BDDE، NAOH، اور آٹوکلیونگ کے عمل پر ہے، لیکن اس کا HA سے ​​کوئی تعلق نہیں ہے۔
تقریباً 2.71 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت پائی جانے والی نئی چوٹی پھر LC-MS کی خصوصیت تھی۔اس مقصد کے لیے، BDDE (9.9 mg/mL) کو 1% NaOH آبی محلول میں انکیوبیٹ کیا گیا اور آٹوکلیو کیا گیا۔جدول 4 میں، نئی چوٹی کی خصوصیات کا موازنہ معروف BDDE حوالہ چوٹی (برقرار رکھنے کا وقت تقریباً 3.47 منٹ) سے کیا گیا ہے۔دو چوٹیوں کے آئن فریگمنٹیشن تجزیہ کی بنیاد پر، یہ نتیجہ اخذ کیا جا سکتا ہے کہ 2.72 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت کے ساتھ چوٹی BDDE چوٹی کی طرح کے ٹکڑے دکھاتی ہے، لیکن مختلف شدت کے ساتھ (شکل 6)۔2.72 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت (PIS) کے مطابق چوٹی کے لئے، 147 Da کے بڑے پیمانے پر ٹکڑے ٹکڑے ہونے کے بعد ایک زیادہ شدید چوٹی دیکھی گئی۔اس عزم میں استعمال ہونے والے BDDE ارتکاز (9.9 mg/mL) پر، الٹرا وایلیٹ سپیکٹرم میں مختلف جاذب طریقوں (UV, λ=200 nm) کو بھی کرومیٹوگرافک علیحدگی (شکل 7) کے بعد دیکھا گیا۔2.71 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت کے ساتھ چوٹی اب بھی 200 nm پر نظر آتی ہے، جبکہ BDDE چوٹی کو انہی حالات میں کرومیٹوگرام میں نہیں دیکھا جا سکتا۔
جدول 4 نئی چوٹی کی خصوصیات کے نتائج جس کا برقرار رکھنے کا وقت تقریباً 2.71 منٹ اور BDDE چوٹی 3.47 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت کے ساتھ
نوٹ: ان نتائج کو حاصل کرنے کے لیے، LC-MS اور HPLC تجزیہ (MRM اور PIS) دو چوٹیوں پر کیے گئے۔HPLC تجزیہ کے لیے، 200 nm کی طول موج کے ساتھ UV کا پتہ لگانے کا استعمال کیا جاتا ہے۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;HPLC، اعلی کارکردگی مائع کرومیٹوگرافی؛LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی؛m/z، ماس ٹو چارج تناسب؛پی آئی ایس، پروڈکٹ آئن سکیننگ؛بالائے بنفشی روشنی، بالائے بنفشی روشنی.
نوٹ: بڑے پیمانے پر ٹکڑے LC-MS تجزیہ (PIS) کے ذریعے حاصل کیے جاتے ہیں۔ٹاپ کرومیٹوگرام: بی ڈی ڈی ای معیاری نمونے کے ٹکڑوں کا ماس سپیکٹرم۔باٹم کرومیٹوگرام: نئی چوٹی کا بڑے پیمانے پر سپیکٹرم کا پتہ چلا (BDDE چوٹی سے وابستہ RRT 0.79 ہے)۔BDDE کو 1% NaOH سلوشن میں پروسیس کیا گیا اور اسے آٹوکلیو کیا گیا۔
مخففات: BDDE، 1,4-butanediol diglycidyl ether;LC-MS، مائع کرومیٹوگرافی اور ماس اسپیکٹومیٹری؛MRM، ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی؛پی آئی ایس، پروڈکٹ آئن اسکین؛RRT، متعلقہ برقرار رکھنے کا وقت۔
شکل 7 203.30 Da پیشگی آئن کا آئن کرومیٹوگرام، اور (A) 2.71 منٹ کے برقرار رکھنے کے وقت کے ساتھ نئی چوٹی اور (B) 200 nm پر 3.46 منٹ پر BDDE حوالہ معیاری چوٹی کا UV پتہ لگانا۔
تیار کردہ تمام کراس سے منسلک HA ہائیڈروجلز میں، یہ دیکھا گیا کہ LC-MS کی مقدار کے بعد بقایا BDDE ارتکاز <2 ppm تھا، لیکن تجزیہ میں ایک نئی نامعلوم چوٹی نمودار ہوئی۔یہ نئی چوٹی BDDE معیاری مصنوعات سے مماثل نہیں ہے۔BDDE معیاری پروڈکٹ نے بھی مثبت MRM موڈ میں اسی کوالٹی کنورژن (MRM کنورژن 203.30/129.10 Da) کا تجزیہ کیا ہے۔عام طور پر، دیگر تجزیاتی طریقے جیسے کرومیٹوگرافی کو ہائیڈروجلز میں BDDE کا پتہ لگانے کے لیے حد ٹیسٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، لیکن زیادہ سے زیادہ پتہ لگانے کی حد (LOD) 2 ppm سے تھوڑی کم ہے۔دوسری طرف، اب تک، NMR اور MS کا استعمال کراس سے منسلک HA مصنوعات کے شوگر یونٹ کے ٹکڑوں میں HA کی کراس لنکنگ اور/یا ترمیم کی ڈگری کو نمایاں کرنے کے لیے کیا گیا ہے۔ان تکنیکوں کا مقصد کبھی بھی اتنی کم ارتکاز میں بقایا BDDE کی کھوج کی مقدار درست کرنا نہیں تھا جیسا کہ ہم اس مضمون میں بیان کرتے ہیں (ہمارے LC-MS طریقہ کا LOD = 10 ppb)۔